UNDER CONSTRUCTION

1. Short Interspersed Elements (SINEs):
Structure, Evolution, Transcription, and Transcript Processing.

 

Короткие ретропозоны, или SINEs (Short Interspersed Elements) представляют собой рассеянные по геномам эукариот мобильные генетические элементы длиной от 80 до 400 п.н., амплификация которых происходит с помощью обратной транскрипции (см. обзор Kramerov and Vassetzky, 2005). Впервые они были обнаружены в геномах мыши (Kramerov et al., 1979; Krayev et al., 1980, 1982) и человека (Rubin et al., 1980; Deininger et al., 1981). SINEs делятся на семейства; нуклеотидные последовательности SINEs, входящих в одно семейство, как правило, обладают 65 – 90%-ным сходством. У  млекопитающих одного вида в геноме обычно имеется 2 – 4 семейства SINEs, каждое из которых содержит от 10 тысяч до миллиона  копий.  SINEs транскрибируются РНК-полимеразой III благодаря наличию в их 5’–концевой части промотора РНК-полимеразы III, состоящего обычно из двух боксов (А и В), которые разделены последовательностью длиной 30-40 п.н. SINEs относятся к неавтономным мобильным элементам, поскольку не кодируют собственных ферментов и используют для своего размножения обратную транскриптазу, закодированную в одном из видов длинных ретропозонов, или LINEs (Long Interspersed Elements). Большинство SINEs млекопитающих размножается с помощью так называемого LINE-1 (см. обзор Kramerov and Vassetzky, 2005).


Сотрудниками лаборатории описана приблизительно треть всех известных к настоящему времени семейств коротких ретропозонов млекопитающих. На филогенетическом древе млекопитающих такие короткие ретропозоны выделены красным (рис. 1). Для обнаружения и клонирования новых семейств SINEs в лаборатории были разработаны методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных боксам А и В промотора РНК-полимеразы III (Borodulina and Kramerov, 1999, 2001, 2005; Косушкин и др., 2006). Кроме того, для поиска и анализа  новых SINEs используются биоинформационные методы (Vassetzky and Kramerov, 2002; Vassetzky et al., 2003; Veniaminova et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют о том, что SINEs имеются у всех млекопитающих, а также рептилий и широко распространены среди многоклеточных.


Известно, что большинство семейств SINEs ведет свое происхождение от тРНК: последовательность, сходная с одной из таких РНК, располагается на 5'-конце SINE. Далее в SINEs следует участок неизвестного происхождения, а затем «хвост», богатый адениловыми остатками. Мы заметили, что SINEs некоторых семейств состоят лишь из тРНК-родственной последовательности и А-богатого хвоста; они были названы простыми  SINEs (Borodulina and Kramerov, 2005, 2006). В эволюции такие генетические элементы могут порождать более сложно устроенные и «успешные» короткие ретропозоны. Один из распространенных путей эволюции SINEs – их димеризация, то есть образование новых SINEs путем соединения двух ранее существовавших (Vassetzky and Kramerov, 2002; Vassetzky et al., 2003; Gogolevsky and Kramerov, 2006; Veniaminova et al., 2007).


Значительно более редким по сравнению с тРНК источником  SINEs является 7SL РНК – компонент сигнал-узнающих частиц (SRP), которые участвуют в трансляции секретируемых и мембранных белков (Ullu and Tschudi, 1984). К таким семействам  SINEs относятся В1-элементы, свойственные всем грызунам (Krayev et al., 1980; Vassetzky et al., 2003; Veniaminova et al., 2007), Alu-элементы приматов (Deininger et al., 1981; Zietkiewicz et al., 1998) и низкокопийные SINEs тупай (Nishihara et al., 2002;  Vassetzky et al., 2003).


5S рРНК – третий тип РНК, синтезирующихся РНК-полимеразой III и дающих начало семействам SINEs. Активные семейства таких SINEs распространены среди рыб, хотя их фрагменты в небольшом числе встречаются также в геномах млекопитающих и птиц (Kapitonov and Jurka 2003; Nishihara et al., 2006). В геноме грызуна  капского долгонога мы обнаружили молодое активное семейство  SINE (Ped-1), содержащее на 5’-конце ретропозона последовательность, родственную 5S рРНК (Gogolevsky et al., 2008). Многочисленные 5S рРНК-родственные SINEs найдены нами и в геномах крыланов (Megachiroptera) (статья готовится к печати). Однако, по-видимому, 5S рРНК генерировала  SINEs в ходе эволюции значительно реже, чем различные виды тРНК.
3'-концевая часть  SINEs не менее важна и интересна, чем 5'-концевая, несущая промотор для РНК-полимеразы III. В отличие от А-богатого хвоста, характерного для большинства SINEs млекопитающих, хвосты SINEs рыб и рептилий состоят из небольшого числа прямых коротких повторов. Такому хвосту предшествует участок длиной 50-100 п.н., гомологичный  3'-концевой части того или иного LINE, например, L2, L3 или CR1. Вся эта часть SINE очень важна для его ретропозиции, поскольку ответственна за узнавание и связывание РНК SINE обратной транскриптазой, закодированной в соответствующем LINE (Ohshima and Okada, 2005). У млекопитающих несколько семейств SINEs имеют такое же строение. Особо нужно отметить SINEs, ретропозиция которых связана с активностью LINE Bov-B. Мы  недавно обнаружили (Gogolevsky et al., 2008), что, помимо Bov-tA жвачных (Okada and Hamada, 1997) и Mar-1 сумчатых (Gilbert and Labuda, 2000), к ним относятся SINEs Ped-1 и Ped-2 капского долгонога, а также AfroSINE из геномов слонов, даманов, сирен, трубкозубов, прыгунчиков, тенреков и златокротов (надотряд Afrotheria). 3'-концевая половина всех этих SINEs имеет уникальное строение: она состоит из двух участков, гомологичных соответственно 5'- и 3'-районам LINE Bov-B (рис. X) . Вероятно, оба эти участка важны для узнавания таких SINEs обратной транскриптазой Bov-B.


Особое внимание в наших исследованиях уделено А-богатым хвостам SINEs млекопитающих. Мы обнаружили, что все такие SINEs можно разделить на два класса: T+ и Т  (Borodulina and Kramerov, 2001). SINEs класса T+ в своих А-богатом хвостах содержат гексануклеотид(ы) AATAAA и терминатор транскрипции (TTTT  или TCTTT). Такие последовательности отсутствуют у SINEs класса Т.  Было высказано предположение, что РНК, транскрибирующаяся с SINEs класса T+ РНК-полимеразой III, может полиаденилироваться благодаря наличию около ее 3'-конца гексануклеотида(ов) AAUAAA. (Как известно, AAUAAA служит сигналом полиаденирования в РНК, транскрибирующихся РНК-полимеразой II). При изучении транскриптов В2-элемента (первого из описанных SINEs класса T+) в клетках мыши были получены свидетельства о наличии длинных сегментов поли(А) на их 3'-концах (Kramerov et al., 1982, 1985, 1990). Используя трансфекцию клеток человека В2-элементом с мутациями и без них, мы однозначно доказали, что В2 РНК подвергается полиаденилированию (рис. X; Borodulina and Kramerov, in press). Это первый пример РНК, транскрибируемой РНК-полимеразой III, которая подвергается полиаденилированию, зависящему от AAUAAA-сигнала. Описанное явление очень интересно, так как имевшиеся до настоящего времени данные указывали на тесную связь лишь между транскрипцией генов РНК-полимеразой II и полиаденилированием образующейся РНК. Изучение полиаденилирования транскриптов, образованных РНК-полимеразой III, является одной из наиболее актуальных тематик лаборатории.

 

2. SINEs and Satellite DNA as Tools to Study Host Phylogeny.


Изучая таксономическое распространение семейств SINEs у млекопитающих, мы пришли к выводу, что они могут быть использованы для выяснения филогенетических связей между таксонами среднего уровня – семействами или отрядами (Serdobova and Kramerov, 1998). Однажды возникнув в геноме какого-то вида, семейство SINEs предается в эволюции всем видам, ведущим от него свое происхождение. Независимое возникновение одного и того же семейства SINEs в геномах двух разных видов представляется событием крайне маловероятным. Таким образом, виды, которые обладают SINEs, относящимися к одному семейству, ближе друг к другу, чем  прочим видам. Используя данный подход, мы подтвердили родственность отрядов грызунов, приматов и тупай (Vassetzky et al., 2003), изучили филогенетические связи между рядом семейств грызунов (рис. X) и, в частности, показали, что сони (Gliridae) родственны не миоморфным грызунам, как считалось ранее, а белкам (Sciuridae) (Kramerov et al., 1979). Изучение нуклеотидных последовательностей SINE В1 из различных семейств грызунов позволило нам проанализировать филогенез этого отряда и получить аргументы в пользу раннего отделения ветви Gliridae-Sciuridae-Aplodontia от древа остальных грызунов (Kramerov et al., 1999; Veniaminova et al., 2007; Вениаминова и др., 2007).


В лаборатории совместно с сотрудниками МГУ (А. Банниковой и В. Матвеевым) применяется также другой подход к изучению филогенетических связей, основанный на использовании SINEs.  Этот метод, называемый интер-SINE-ПЦР, заключается в проведении полимеразной цепной  реакции (ПЦР) геномной ДНК с использованием праймеров, комплементарных SINE одного из семейств, в ходе которой происходит амплификация  участков ДНК между близко (до 3000 п.н.)  расположенными копиями SINEs. Сравнение наборов амплифицированных фрагментов ДНК, выявляемых в результате электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле, позволяет построить филогентическое древо исследуемой группы организмов. Метод применим для анализа низших таксонов – подвидов, видов и, в некоторых случаях, родов. С помощью интер-SINE-ПЦР изучались родственные связи среди летучих мышей семейства Vespertilinidae (Банникова и др. 2002; Matveev et al., 2005), ежей (Банникова и др., 2003), землероек (Bannikova et al., 2003, 2005, 2006),  обезьян старого Света и Homo sapiens (Рябинина и др., 2008). В настоящее время этот метод мы используем для изучения филогенетических связей между видами ящериц рода Darevskia и Lacerta (Гречко и др., 2006; Гречко и др., 2007). 


В лаборатории проводятся также исследования сателлитных повторов геномов чешуйчатых рептилий (отр. Squamata) – с целью выяснения молекулярно-генетических связей между таксонами. Из генома скальных ящериц Кавказа выделено, секвенировано и охарактеризовано четыре семейства сателлитных повторов (CLsatI-IV), обладающих специфическими свойствами на уровне родов семейства Lacertidae (Grechko et al., 1997; Fedorov et al., 1998; Чобану и др., 2002, 2003). Свойства, содержание и соотношение разных вариантов сателлитных повторов у видов и родов семейства оказались хорошими молекулярно-генетическими признаками, на основе которых изучено  родство множества видов, подвидов и популяций ящериц рода Darevskia, морфологическая таксономия которых чрезвычайно сложна и запутана (Ciobanu et al., 2004; Grechko et al., 2006). Использование сателлитных маркеров на низших уровнях таксономии полезно и перспективно и позволило выяснить некоторые спорные вопросы видообразования и биоразнообразия этих животных (Гречко, 2002).

 

3. Small SINE-Related RNAs.

 

В клетках мышей и крыс существует две своеобразные малые РНК, обозначаемые как 4.5SH и 4.5SI (Ro-Choi et al., 1972; Harada and  Kato, 1980; Schoeniger and Jelinek, 1986). Обе эти РНК не обнаруживаются в клетках человека. 4.5SH РНК имеет явную гомологию с SINE B1 (Krayev et al., 1982; Kramerov et al., 1982), хотя и короче его (94 н. против 130 п.н.). 4.5SI РНК длиною в 98 н. обладает некоторым сходством нуклеотидной последовательности с другим SINE – B2 (Krayev et al., 1982; Serdobova and Kramerov, 1998). Обе РНК имеют преимущественно ядерную локализацию. Часть молекул 4.5SH нековалентно  связана с поли(А)-содержащими РНК (видимо, мРНК) (Schoeniger and Jelinek, 1986). Роль обеих малых РНК остается неясной.


Исследования, проводимые в нашей лаборатории (Gogolevskaya and Kramerov, 2002; Gogolevskaya et al., 2005), показали, что распространение 4.5SI и 4.5SH  РНК  ограничено соответственно четырьмя и шестью семействами грызунов (рис. X). При этом распространение 4.5SI РНК и SINE B2 одинаково; это позволяет предположить, что они возникли в эволюции грызунов приблизительно в один и тот же период времени. Распространение  4.5SH  РНК  намного уже, чем распространение гомологичного ей SINE B1 (рис. X). Предполагается, что ген этой малой РНК произошел из одной из копий В1. Нуклеотидные последовательности каждой из двух малых РНК весьма консервативны, то есть они, видимо, обладают определенными функциями и подвержены отбору. Таким образом, 4.5SI и 4.5SH  РНК могут служить примерами приобретения функции  нефункциональными нуклеотидными последовательностями.


Также как в геномах мышей (Schoeniger and Jelinek, 1986), в геномах хомяков, слепышей и тушканчиков (Gogolevskaya et al., 2005) 4.5SH  РНК закодирована в сотнях генов, входящих в состав протяженных (4-5 тыс. п.н.) тандемных повторов (один ген в одном повторе). Нуклеотидные последовательности повторов (исключая сам ген) у грызунов разных семейств не имеют сходства, то есть они мало подвержены отбору (Gogolevskaya et al., 2005).


В настоящее время мы изучаем значение нуклеотидных последовательностей, непосредственно прилегающих к генам  4.5SH и 4.5SI РНК, для их транскрипции. 

 

4. Small Nucleolar RNAs (snoRNAs) and Their Host Genes.


Известно, что более 100 нуклеотидов в рРНК подвергаются метилированию по 2'-OH группе рибозы. Установлено, что направляют эту реакцию многочисленные малые ядрышковые РНК семейства C/D (см. обзор Макарова и Крамеров, 2007a). Каждая из этих РНК узнает определенный участок в рРНК, благодаря присутствию в них так называемых антисенс-элементов длиной 10-12 н.   Характерной особенностью этих малых ядрышковых РНК является наличие боксов C и C', а также D и D'. У позвоночных C/D РНК закодированы в интронах ряда генов, называемых генами-хозявами; малые РНК вырезаются из интронных участков после сплайсинга пре-мРНК (см. обзор Макарова и Крамеров, 2007b).


В клетках крысы мы обнаружили новую малую ядрышковую C/D РНК, названную U87, которая, судя по структуре ее антисенс-элемента, участвует в метилировании G 28S рРНК в позиции 3468 (Gogolevskaya et al., 2002; Макарова и Крамеров, 2005).  U87 РНК была обнаружена и в клетках млекопитающих других видов, включая человека. Далее мы установили, что эта РНК закодирована в интроне ранее неизвестного гена, который получил название U87HG (Makarova and Kramerov, 2005; Макарова и Крамеров, 2005). Этот ген-хозяин весьма необычен: его экзоны не содержат длинных открытых рамок считывания и, таким образом, не кодируют никаких белков. Кроме U87HG известно только четыре не кодирующих белки генов-хозяев малых ядрышковых РНК.


В ходе текущего проекта мы осуществляем поиск новых малых ядрышковых C/D РНК у позвоночных.

 

› Start Page